Rapport for året 2001 for FIBP

1. Resultater opnået i København af post doc Charlotte Hougård ( ansat i 5 måneder på FIBP) og Else Hoffmann

Vi har forsøgt at få så ren en primær kultur vi kunne af myoblaster til elektrofysiologiske forsøg. Det var vores ide at en sådan kultur kunne etableres ud fra en blandet primær kultur bestående af fibroblaster og myoblaster ved at lade disse kulturer vokse under betingelser hvor vækst af myoblaster favoriseres.

Forsøgsmateriale

Primære kulturer af muskelceller forsøgtes i første omgang lavet fra muskel isoleret fra 1 år gamle regnbue ørreder. Udbyttet af myoblaster i disse præparationer var dog meget lave (forholdet mellem myoblaster og fibroblaster var omkring 1:25). Det er kendt fra andre systemer (f.eks. rotter) at udbyttet af myoblaster falder som funktion af forsøgsdyrets alder, og for at optimere myoblast udbyttet lavede vi primære kulturer fra nyklækkede ørred larver og ørreder < 6 måneder gamle.

Klækning af larver

De uklækkede æg blev opbevaret liggende på et 1 mm-masket plastik net, mørkt ved 8°C i ¼ vandværksvand og ¾ destilleret vand. Vandet blev kraftigt iltet og renset vha. et aktivt kul filter. Forud for klækning blev vandet skiftet 2 x om ugen, efter klækning hver dag. Umiddelbart efter klækning blev larverne fortsat opbevaret som beskrevet ovenfor, men ca. en måned efter klækning overført til kar indeholdende 100% vandværksvand ved 20°C og en lys/mørke cyklus på 12 timer. Desuden blev de fodret hver anden dag med kommercielt tilgængeligt ørredfoder.

Etablering af primær cellekultur fra regnbue ørred muskel

Flere forskellige metoder til etablering af myoblast kulturer blev forsøgt, bl.a. metoder der tidligere med succes har været anvendt til etablering af muskelcelle kulturer fra rotter (2 forskellige metoder anvendt her på August Krogh Instituttet), lampretter (Ma & Collodi, 1999). De bedste resultater (højest myoblast:fibroblast ratio) er dog opnået ved at bruge en let modificeret udgave af metoden beskrevet af Matschak & Stickland (1995) til isolering af myosatelit celler fra Atlanterhavs laks (i stedet for DMEM anvendes L15 medium da dette medium er specielt velegnet til cellekulturer der vokser i atmosfærisk luft, og i stedet for 11°C inkuberes celler ved 18°C) og oprensning af myoblast celler ved adhesion til laminin-behandlede overflader som beskrevet af Koumans et al. (1990).

I denne kultur er forholdet mellem myoblaster og fibroblaster som udgangspunkt ca. 1:1. Da fibroblaster, men ikke myoblaster vokser i disse kulturer, vil forholdet mellem myoblaster og fibroblaster i løbet af få uger falde, og til sidst synes kulturen at være en næsten ren fibroblast kultur. Selvom vi endnu ikke har haft succes med at etablere en ren myoblast kultur, har det dog været muligt at lave en række elektrofysiologiske forsøg på enkelt celler, da myoblasterne adskiller sig klart fra fibroblasterne i deres tenform (de første dage efter isolering) og efterfølgende fusion til fler-kernede myorør og derfor let kan kendes i et mikroskop og udvælges til elektrofysiologiske målinger.

Effekt af kemisk iltmangel på hel-celle strømme i myoblaster fra regnbue ørred

De elektrofysiologiske målinger bliver udført ved brug af hel-celle patch clamp teknikken. Denne teknik er særdeles velegnet til at studere iontransport via kanaler og har den store fordel at cellens ionsammensætning kan kontrolleres og man derved let kan bestemme hvilken type ionkanal (f.eks. K+, Na+, Cl-) der aktiveres. Iltmangel induceres ved at udsætte cellerne for 10 mM azid, som hæmmer den oxidative metabolisme ved at hæmme elektron overførsel mellem cytochrom oxidase komplekset og oxygen. Forsøgene udføres i nærvær af glukose, så cellerne forventes at opretholde et vist energiniveau ved at øge den glykolytiske proces.

Eksponeres myoblaster for azid induceres en stor udadrettet helcelle strøm og vendepotentialet flytter nærmere ligevægtspotentialet for K+, hvilket indikerer at det er primært K+ kanaler der aktiveres af azid mens Cl- kanaler er upåvirket eller måske endda hæmmes af denne behandling. Det er endnu uklart hvilke K+ kanaler der bidrager til den azid-inducerede K+ strøm, men foreløbige undersøgelser kunne tyde på at både Ca2+-aktiverede og indad-rektificerende K+ kanaler aktiveres af kemisk iltmangel. Dette er vi ved at undersøge nærmere.

Det er planen at dette i 2002 skal færdiggøres til publikation

Referencer
Koumans, J.T.M., Akster, H.A., Dulos, G.J. & Osse, J.W.M. (1990) Cell Tissue Res. 261:173-181

Ma, C. & Collodi, P. (1999) Meth. Cell Sci. 21:39-46

Matschak, T.W. & Stickland, N.C. (1995) Experientia 51:260-266

2. Resultater opnået af Ph.D. Carlo Ossum (ansat 1 august) I Canada - University of Waterloo

I perioden 30. august til 15. december 2001 besøgte Carlo Ossum professor Niels C. Bols' lab ved University of Waterloo, ON, Canada. Formålet med opholdet var at udvikle permanente myoblast, bindevævs og fedtvævs celle linjer fra fisk. Forsøg på dette blev gjort med regnbue ørred og amerikansk ferskvansål. En enkel protokol for isolering af myoblaster blev udarbejdet, men det lod sig ikke gøre at holde prolifererende myoblaster i kultur. Derimod blev en bindevævs fibroblast lignende celle type fundet i muskel præparaterne som. i dag stadig vokser i kultur og sikkert vil resultere i en permanent celle linje.

Foruden arbejdet med muskelvæv fra fisk blev en cellelinje (RTHD) isoleret fra underhudsfedt hos regnbue ørred karakteriseret med hensyn til basale parametre som væksthastighed og karyotype. Der blev også udført forsøg på denne opnåede cellelinie med henblik på celleliniens anvendelighed til studier af svar på forskellig former for stress som iltmangel, temperatur chok, UV-stråling og xenobiotika.

Det er i 2002 planen at arbejdet med den etablerede fedtcellecellelinie skal færdiggøres til publikation her på laboratoriet af Carlo Ossum og Else Hoffmann, samt at arbejdet med at få etableret muskelcellelinen og bindevævscellelinien skal fortsætte. Desuden skal arbejdet med proteom karakteriseringen ( det vil sige en fastlæggelse af samtlige proteiner som cellerne indeholder) i muskelceller, bindevævsceller og fedtceller fra regnbueørreden påbegyndes af den nye Ph.D. studerende vi håber at få.

Underprojektet: Biochemical and physiological properties of the enzyme responsible for formaldehyde formation in fish during storage.

Projektleder: Vibeke Barkholt, BioCentrum, DTU og Bo Jørgensen (DIFRES)

Baggrund

Ved frysning af fisk af torskefamilien sker der en uønsket dannelse af formaldehyd og dimethylamin. Begge stoffer forårsager en betydelig forringelse af disse produkter. Formaldehyd og dimethylamin dannelsen skyldes enzymet, trimethylamin-N-oxid aldolase (”TMAOase”, EC 4.1.2.32), som primært findes i fisk af torskefamilien. Enzymets proteinkemiske og katalytiske egenskaber er kun delvist beskrevet og dets fysiologiske funktion er uafklaret. Projektets formål er, at oprense TMAOase med henblik på enzym karakterisering, sekvensering og fremstilling af antistoffer.

Resultater opnået på Danmarks Fiskeriundersøgelser (DIFRES) af post doc Michael K. Nielsen (ansat på FIBP siden 1. juni)

Oprensning af enzymet, TMAOase

Det er blevet forsøgt at oprense TMAOase fra galdesaft. Galdesaft er velegnet til eksperimentel enzymoprensning, fordi det kun indeholder meget lidt protein sammenlignet med andre organer, som indeholder TMAOase.

Tidligere målinger har dokumenteret et højt indhold af TMAOase i galdesaft fra mørksej, men det blev i første omgang undersøgt om galdesaft fra torsk har en tilsvarende sammensætning idet indsamling af galdesaft fra torsk er lettere.

Det viste sig imidlertid, at TMAOase indholdet i galdesaft fra torsk er mange gange lavere i torsk end i mørksej (mens det forholder sig omvendt i hvid muskel fra de to arter). Der er dog en meget stor variation i TMAOase koncentrationen i både muskel væv og galdesaft fra begge arter.

Opdagelsen gav initiativ til en screeningsundersøgelse af torskefisk, som det er beskrevet herunder, men viser også at galdesaft fra torsk er uegnet som udgangsmateriale for enzymoprensning. Galdesaft fra mørksej er vanskelig at indsamle fordi de fleste mørksej primært fanges i bifangster på lange togter i bl.a. Nordsøen og Skagerrak og landes i renset stand. Det er dog lykkedes at fremskaffe rent opsamlet galdesaft fra mørksej med hjælp fra videnskabeligt personale fra DIFRES samt med hjælp fra Aage Thaarup, HFI, (DFU, Hirtshals). Galdesaften blev opsamlet med en kanyle gennem galdeblæren på en nyslagtet mørksej. Der er foreløbig blevet indsamlet galdesaft fra 12 store fisk.

1.4 ml af mørksej-galdesaft med høj TMAOase aktivitet blev fortyndet i 0,1 M NaPi, 1 M NaCl, 1 M NH4Cl, 0,8% CHAPS, pH 7,2. Uopløselige bestanddele blev bortcentrifugeret og resten blev brugt til oprensning med to effektive chromatografi metoder, der er blevet udviklet til oprensning af TMAOase.

Prøven blev først sat direkte på en Cu2+-mættet immobiliseret metalion affinitets chromatografi (IMAC) kolonne (Pharmacia 17-0403-01). Ca. 99 % af UV280 nm absorbansen bandt ikke på kolonnen ved vask med fortyndingsbufferen. Mindst 75 % af TMAOase aktiviteten blev herefter elueret med en negativ pH gradient med buffer B (0,1 M NaPi; 50 mM acetat, 1 M NaCl, 0,8% CHAPS, pH 3,50). Protein oprensnings faktoren var dog mindre end indikeret af 280 nm absorbansmålingerne pga. andre UV absorberende forbindelser i galdesaften.

De reneste IMAC elueringsfraktioner blev opkoncentreret med ultrafiltrering (Gelman Microsep, 10 kDa) og sat på en 1 ml octyl-sepharose hydrofob interaktions chromatografi (HIC) kolonne. Kolonnen blev gennemvasket med 100 mM NaPi, 1 M NaCl, 0.1% CHAPS, pH 7, hvorefter TMAOase blev elueret af detergentet CHAPS med en lineær gradient af 100 mM NaPi, 1 M NaCl, 1.0% CHAPS, pH 7.

En SDS PAGE renhedsbedømmelse viste, at der kun var få proteiner tilbage efter 1. chromatografitrin, hvoraf de fleste kunne være blevet fjernet efter 2. chromatografitrin. Renhedsbedømmelsen var vanskelig fordi oprensningsfraktionerne indeholdt meget lidt protein men høje koncentrationer af salte og detergent. Derfor blev renheden ikke også bedømt med SDS PAGE efter 2. chromatografitrin. I stedet blev alle fraktioner med TMAOase overført til en opløsning indeholdende 0.5% SDS og påsat en gelfiltreringskolonne for herved både at få information molekylvægt og eventuelle urenheder.

Tidligere målinger har vist, at TMAOase tåler behandling med SDS, men i dette tilfælde lykkedes det ikke at genfinde TMAOase aktivitet efter det gelfiltreringen. Inaktiveringen med gelfiltrering i SDS kunne skyldes dissociering, selvom dette ikke kunne dokumenteres ved en senere pooling af gelfiltreringsfraktioner.

Baseret på ovennævnte erfaringer er der i øjeblikket ved at blive oprenset en ny og større portion TMAOase med let modificerede IMAC og HIC chromatografi metoder. Det forventes, at præparatet herefter vil være tilstrækkeligt rent til sekvensering. Om nødvendigt kan produktet fra de to successive oprensningstrin separeres med SDS PAGE.

Screening af torskefisk for TMAOase

De store variationer i indholdet af TMAOase i væv fra nært beslægtede fiskearter bidrager til det ubesvarede spørgsmål om enzymets fysiologiske funktion. Opdagelsen har i første omgang ført til en større indsamling af vævsprøver fra forskellige arter fra torskefamilien. Indholdet af TMAOase i hvid muskel, milt, galdeblære og pyloric caeca (”blindtarm”) fra disse fisk vil blive undersøgt og korreleret med informationer om fiskenes art, køn, størrelse, fangststed og årstid. Organerne indsamles af videnskabeligt personale fra DIFRES på togter med skibet, Dana. som et bi-projekt til deres primære opgaver ombord. Prøverne vil blive analyseret i forbindelse med et laborant elev-projekt i maj måned 2002.

Dannelse af formylerede aminosyrer ved fryselagring af torskemuskel

10 prøver at torskemuskel med kendte indhold af TMAOase aktivitet har været frosset ved –10 °C siden september 2001.

Prøver med både høj og lav TMAOase aktivitet vil blive analyseret for deres indhold at formylerede aminosyrer.